文献赏析

华盈视角:肠道菌群—胆汁酸—肿瘤免疫三元调控与肝癌发生的秘密

2019/02/14

        原发性肝癌和肝转移目前是癌症相关死亡的主要原因之一,肝肠循环是肝脏与小肠发生互通的主要渠道。已有研究发现肝脏可以通过门静脉接触到肠道细菌代谢物,肝脏疾病通常与肠道菌群的组成或失调有关,但是肠道微生物是否与肝癌形成有关?其具体机制如何?科学界尚未探明。最近,发表在《Science》上的一项研究发现了肠道菌群-胆汁酸代谢-肿瘤免疫三元调控关系对于肝癌形成的重大作用,受到科学界广泛关注。

 

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1、肠道微生物群对肝癌的抑制作用

        为了研究肠道菌群对肿瘤的影响,作者使用了不同的肝癌荷瘤小鼠模型,利用抗生素混合物(ABX,由万古霉素、新霉素和复方亚胺硫霉素组成)清除小鼠的肠道共生菌,发现接受抗生素治疗的小鼠中,MYC转基因小鼠诱导的原发性肝癌肿瘤模型肿瘤数量、体积减小(图1A);皮下植入EL4胸腺肿瘤模型,肿瘤生长不受影响,但肝转移减少(图1B);脾内肿瘤模型,肝转移减少,肺转移增加(图1C);通过尾静脉肿瘤模型,确证了抗生素ABX能引起肝脏选择性抑瘤(图1D)。 这些结果表明,肠道微生物可以特异性地改变肝内肿瘤的生长动力学。

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图1 不同模型中肠道微生物改变对肝脏肿瘤的抑制作用


2、肝脏NKT细胞介导肿瘤抑制

        为什么对肠道菌群的清理,肿瘤生长受到抑制呢?为了探索肿瘤抑制背后的机理,对免疫细胞亚群上进行研究,发现ABX处理EL4皮下肿瘤模型小鼠和MYC小鼠肝癌模型小鼠中的肝脏自然杀伤T(NKT)细胞均显著增多,而肾脏NKT细胞保持不变(注:CD1d是NKT细胞的表面marker),表明免疫细胞聚集的肝脏特异性(图2A-B)。进一步研究发现,ABX处理的无瘤小鼠比未经ABX处理的小鼠,肝脏中NK细胞的绝对数量和相对比例均有升高(图2C-D)。以上结果提示:ABX治疗后,NKT细胞的聚集可能是抑制肿瘤的主要原因。

 

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图2 清除肠道共生菌后肝脏NKT细胞与肿瘤的变化


        为了进一步验证肝脏NKT细胞的作用,采用抗CD4的抗体清除NKT细胞后,发现即使小鼠接受ABX治疗,肿瘤依然迅速发展,而采用抗CD8的抗体清除CD8+T细胞后,ABX治疗可以明显抑制肿瘤生长(图2E-F),综合表明肝脏NKT细胞对肠道微生物引起的肝脏肿瘤生长是必需的。


3、胆汁酸/CXCL16/CXCR6轴控制肝脏NKT聚集

       有文献正证实趋化因子受体CXCR6介导NKT细胞在肝脏中的活性和聚集,作者发现了所有肝NKT细胞中均表达趋化因子受体CXCR6,且肝脏内表达CXCR6的细胞中75%都是NKT细胞,这一比例在ABX处理后也没有变化,并且ABX处理的小鼠NKT细胞更加活跃(图3A-C)。特异性抗原刺激后,万古霉素(ABX组分之一)处理的小鼠肝NKT细胞中干扰素-γ(IFN-γ)明显增加(图3D),说明肿瘤免疫已被启动。综上,清除肠道微生物导致肝脏NKT聚集,活化NKT细胞在遇到抗原负载的肿瘤细胞时会产生IFN-γ,抑制肿瘤生长。

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图3 CXCR6介导NKT细胞在肝脏中的存活和积累

 

        进一步研究发现,ABX处理并不改变肝脏NKT表面CXCR6的表达量(图4A),而肝窦内皮细胞(LCEC)表达的CXCL16(CXCR6细胞配体)升高(图4B-C),并且使用CXCL16能使肝脏NKT增加(图4D),因此,ABX促进LCEC表达CXCL16,CXCL16将NKT召集到肝脏发挥抑瘤作用。


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图4 ABX促进LCEC表达CXCL16介导NKT聚集

       
        那么又是什么促进CXCL16的表达呢?

        细胞表面CXCL16已被证实参与了脂质代谢,胆汁酸在脂肪代谢中起着重要作用,而肠道微生物可以调节肠道内胆汁酸代谢和组成。因此作者尝试寻找胆汁酸和CXCL16之间可能存在的联系

        首先使用胆汁酸螯合剂(消胆胺)减少肝脏中的胆汁酸水平,发现肝NKT和CXCR6+细胞增加,与ABX作用类似,提示胆汁酸通过CXCL16调控参与肝NKT细胞聚集(图5A)。 

        通过靶向代谢组学测定肝脏组织中胆汁酸谱,分析参与NKT细胞调节的胆汁酸类型,由于肠道共生细菌可以将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸,在ABX处理的小鼠中,发现初级胆汁酸增加,次级胆汁酸降低,尤其是初级胆汁酸中的T-β-MCA和β-MCA,以及次级胆汁酸中的T-ω-MCA、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、ω-MCA、牛磺胆酸(TLCA)和牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)均显著变化(图5B)。在小鼠原代LSECs中研究胆汁酸对CXCL16表达的影响。发现,初级胆汁酸T-β-MCA促进CXCL16mRNA的表达,而次级胆汁酸ω-MCA则相反(图5C)。

 

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图5 胆汁酸对CXCL16、NKT和肿瘤的影响


        给小鼠喂食胆汁酸,观察肝脏NKT细胞、CXCL16的表达以及肝肿瘤生长的变化,发现喂食次级胆汁酸ω-MCA使肝脏NKT聚集减少,而喂食初级胆汁酸CDCA增强了NKT细胞聚集(图5D)。观察喂食胆汁酸对肝脏肿瘤生长的影响,发现次级胆汁酸LCA或ω-MCA逆转了抗生素引起的肝肿瘤生长抑制,而初级胆汁酸CDCA增强了肿瘤抑制(图5E)。增强CXCL16在肝脏中的表达(图5E)可以消除次级胆汁酸对肝肿瘤生长的影响,表明这种作用是NKT细胞介导的。因此,ABX清除肠道共生菌模型中,诱导CXCL16表达的初级胆汁酸增加,而抑制CXCL16的次级胆汁酸减少,导致了CXCL16的上调和肝NKT细胞聚集,从而发挥抗肿瘤作用。

        进一步,研究人员通过单独使用ABX中的三种抗生素处理以进一步缩小靶向细菌范围。结果发现梭状芽孢杆菌Clostridium scindens在小鼠肠道中参与胆汁酸的代谢,将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸。在抗生素的处理下,此种细菌减少,初级胆汁酸得到积累,进而促进CXCL16的表达、NKT免疫细胞聚集,对肿瘤产生抑制效果(图略)。

 

4、胆汁酸对人肝脏CXCL16表达的调控

        最后,回归人类样本加强证据链。与小鼠类似,初级胆汁酸CDCA和TCA诱导了SK-HEP1中的CXCL16 mRNA表达(图6A)。在肝癌或胆管癌患者的非肿瘤肝组织中,初级胆汁酸CDCA水平与CXCL16表达相关(图6B),而次级胆汁酸GLCA则相反。初级/次级的比值与CXCL16的表达增加有关,表明胆汁酸对CXCL16表达也存在相反作用。最终,在临床样本中得到了细胞和动物模型实验同样的结论。

 

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 图6 胆汁酸对人肝脏CXCL16表达的影响


小结

        本研究将肿瘤发生与肠道菌群、胆汁酸代谢和肿瘤免疫紧密联系,创新性十足。同时,通过详实的数据,证实了肠道微生物利用胆汁酸调控小鼠肝脏NKT细胞聚集,进而介导抗肿瘤免疫的创新机制。为通过调控胆酸代谢和肠道菌群来治疗肝癌,提供了新的理论基础并明确了治疗靶点。

        本文中用到的胆汁酸全谱代谢组学分析和细胞因子筛选两种技术可由华盈生物提供专业的技术服务。

 

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