文献赏析

华盈视角:蛋白质组学技术应用于中药靶点的寻找

2018/12/24

现今全球约三分之一成年人体重超标,与之相伴随的是较高的与肥胖相关的代谢性疾病风险,包括非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病和心血管疾病等。虽然肥胖的病因和发病机制复杂,但是过多的脂质积聚被认为是罪魁祸首。因此,减少脂质积聚和增加脂质消耗可能是改善肥胖症和相关代谢紊乱的有效解决方案。在此基础上,北京大学化学与分子工程学院王初研究员课题组了利用定量蛋白质组学技术,揭示传统中药活性分子黄芩苷治疗肥胖、脂肪肝及其相关代谢疾病的分子机制,确认肉碱酯酰转移酶1(CPT1)是黄芩苷的重要结合蛋白,并通过变构调节增强CPT1的活性,从而促进脂肪酸的氧化降解,发挥降脂和抗脂肪变性功能。相关研究成果发表在国际顶级学术期刊《PNAS》上。

 

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文献解读

1、黄芩苷在细胞内具有降脂活性

 研究人员首先评估了黄芩苷降低哺乳动物细胞系中脂质积累的能力。用1mM油酸和棕榈酸(2:1摩尔比)处理HeLa细胞诱导脂质沉积,当存在过剩的游离脂肪酸时,用一系列浓度的黄芩苷处理细胞24小时,并用油红O(ORO)对细胞进行染色,通过DMSO提取ORO染料,提取的ORO染料的强度反映了脂质积累的程度。结果显示,黄芩苷在浓度低至12.5 μM的情况仍能显著降低细胞内的脂质积累(图1A),并且当约80%的细胞存活时,其在高达400 μM时仍保持其较强的降脂作用(图1B)。100μM的黄芩苷处理已经可以减少细胞内约50%的脂质(图1C)。此外,研究人员从小鼠肝脏中分离出肝细胞,并通过ORO染色证实黄芩苷在降低原代细胞中的脂质积累方面具有相似的活性。

 

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图1 黄芩苷在细胞内具有降脂活性

 

2、黄芩苷靶向脂肪酸氧化关键酶CPT1A

        研究人员采用定量化学蛋白质组学技术来鉴定黄芩苷直接相互作用的靶标蛋白质。首先采用化学合成的方法,设计并合成了含有二甲苯酮光交联基团的光亲和性黄芩苷探针BP(图2A),该探针的特点是通过紫外光照射下可以进一步发生化学反应,与生物素形成完整的探针复合体。尽管有相当大的结构衍生作用,黄芩苷探针仍然能够像天然化合物一样有效地降低脂质积累(图2B)。进一步,利用SILAC蛋白组学技术获得细胞“轻”、“重”蛋白质组,设置实验组和对照组(BP control、CP control、UV control、Competition),通过LC-MS/MS 对靶蛋白进行分析(图2C,该图完美展示了药物靶点研究中的对照设计标准姿势),最终获得142个靶标蛋白(图2D)。对这142个蛋白进行GO分析,结果显示其与脂肪酸降解显著相关,因此,研究人员将该条目下的7种蛋白作为候选靶标蛋白(图2E)。接着,研究人员利用siRNA干扰技术特异性敲减这7个蛋白,观察其对黄芩苷降脂作用的影响,发现CPT1A的敲减完全消除了黄芩苷的降脂作用(图2F),用CPT1A的抑制剂丙二酰辅酶A抑制CPT1A,也能显著减弱黄芩苷的降脂作用,进一步说明CPT1A是黄芩苷的结合靶点。

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图2 黄芩苷靶向脂肪酸氧化关键酶CPT1A

 

3、黄芩苷直接激活CPT1A

 为了确认黄芩苷是否可以直接激活CPT1A,首先Western Blot实验表明,黄芩苷不影响细胞内的CPT1A的蛋白水平(图3A)。酶活性测定实验表明,黄芩苷处理使CPT1A活性增加(图3B),并发现黄芩苷不能激活CPT1的另外两种亚型CPT1B和CPT1C(图3C-D),以上数据表明,黄芩苷直接以特定的亚型选择性活化CPT1A。

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图3 黄芩苷直接激活CPT1A

 

4、黄芩苷可改善小鼠饮食诱导的肥胖(DIO)

研究人员接下来在小鼠体内验证黄芩苷的降脂作用机制。首先给小鼠喂食高脂饮食12周,诱导肥胖和肝脏脂肪变性;在相同的高脂饮食下,胃内给药(每天400mg / kg黄芩苷)12周。结果如预期一样,黄芩苷能降低小鼠体重,降低体脂百分比。并能有效减少肝脏的大小和重量(图4A-D)。

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图4 黄芩苷在小鼠体内具有降脂作用

 

5、CPT1A活化对黄芩苷的降脂作用至关重要

 为了证实CPT1A活化在介导黄芩苷的抗肥胖效应中的作用,研究人员首先使用shRNA干扰降低DIO小鼠的肝脏CPT1A表达,发现黄芩苷所有减肥相关的功效消失(图5A-D),为进一步证明CPT1A的激活对这些有益效果至关重要,分别过表达野生型CPT1A或H327E突变体(不能和黄芩苷结合),发现在敲减CPT1A的肝脏中过表达了野生型CPT1A可以回补黄芩苷的减肥功效,而过表达H327E突变体则不能回补(图5E-G)。以上数据表明,CPT1A活化在黄芩苷的降脂作用中发挥至关重要的角色。

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图5 CPT1A活化对黄芩苷的降脂作用至关重要


小结:

在本研究中,研究人员通过小分子探针技术结合SILAC蛋白质组学技术发现了黄芩苷的结合靶点——CPT1A;随后通过一系列实验证明黄芩苷能够直接激活特定亚型CPT1A,同时CPT1A是黄芩苷在体外发挥降脂功效的关键靶点;最后,在动物水平证明激活CPT1A是黄芩苷发挥功效的关键机理。文中所使用的化学蛋白质组学技术是目前寻找化合物作用靶点的经典方法,研究逻辑严密,值得每位致力于寻找药物靶标的科研人员学习。

SILAC蛋白质组学在筛选互作蛋白研究中具有如下特征性优势:

1、高通量,可同时标记细胞内的蛋白,与质谱联用可同时分析鉴定多种蛋白质;

2、同位素标记效率高、稳定,不受裂解液影响,结果重复性好;

3、凭借体内标记的优势,SILAC标记更好地保留了蛋白质的各种生物学特性,标记效果没有偏性。

英文文献链接: